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本制品是百奥莱博公司开发的专门用于禽传染性支气管炎病毒研究检测的试剂盒。本试剂盒基于RT-LMAP核酸扩增技术，采用可视化及荧光双染料检测，高灵敏、快速地对样品中的禽传染性支气管炎病毒情况进行定性分析。

禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)是一种冠状病毒。其基因组为单链、正向、线性RNA，长度大约为27.6 knt。禽传染性支气管炎病毒流行株与其他株系的主要区别在于其表面蛋白的抗原性。该病毒可能对特定年龄的鸡只具有更高的致病性，并且在某些饲养条件下更容易传播和流行。禽传染性支气管炎病毒所引起的禽传染性支气管炎，常常给家禽养殖业带来重大的经济损失，因此禽传染性支气管炎病毒的快速准确鉴定有重要意义，为此本公司根据独有的双染料RT-LMAP技术，开发了简单快捷的禽传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测试剂盒。

1. 即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
   
2. 恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
   
3. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
   
4. 检测灵敏性一般比RT-PCR高10倍以上，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应左右。
   
5. 特异性高，根据禽传染性支气管炎病毒RNA保守序列设计4条特异引物，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
   
6. 一般30分钟内出结果，比RT-PCR快。
   
7. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
   
8. 本制品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
   
9. 上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到13μL。
   
10. 本制品足够50次20μL体系的染料法荧光及可视化RT-LAMP扩增。
    
11. 只可用于科研。

1. 用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PC)和一个样品制备阴性对照(NC)。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照(10⁴拷贝/μL)加一定量的水充当，总体积必须核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样，NC用水替代。

3. 第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100μL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix(双染料，待加酶)中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。
   
4. 反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP阴性对照和RT-LAMP阳性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	RT-LAMP 阴性对照	RT-LAMP 阳性对照
   RT-LAMP MasterMix (双染料，已加酶)	6μL	6μL	6μL
   20×禽传染性支气管炎病毒RT-LAMP引物混合液	1μL	1μL	1μL
   N+2个样品RNA	13μL	-	-
   超纯水	-	13μL	-
   禽传染性支气管炎病毒RT-LAMP阳性对照(104拷贝/μL)	-	-	13μL

5. 本制品含两种染料，故最好使用荧光PCR仪器进行扩增。设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

6. 电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL RT-LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-LAMP阳性对照必须有正常RT-LAMP条带(200bp左右的梯形扩增产物)，RT-LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果RT-LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：
   
   
7. 可将光(肉眼)分析：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图(9为阴性，10为阳性)。
   
   
8. 荧光分析(仅限于用qPCR仪进行反应的场景)：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和RT-LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。